Reakcja łańcuchowa polimerazy

(Przekierowano z PCR)

Reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) - łańcuchowa reakcja polimeryzacji, metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych, polegająca na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki. Technika wynaleziona w 1983 roku przez Kary Mullisa i współpracowników z kalifornijskiej firmy Cetus.

Do reakcji wprowadza się matrycowy DNA, trifosforany deoksyrybonukleotydów, startery oraz termostabilną polimerazę (może nią być na przykład polimeraza Taq wyizolowana z bakterii Thermus aquaticus lub polimeraza Pfu z bakterii Pyrococcus furiosis. Polimeraza Pfu charakteryzuje się większą progresywnością niż Taq, jednakże działa wolniej. Dostępne są także inne polimerazy, będące z reguły modyfikacjami wyżej wymienionych).W wyższej temperaturze (zwykle około 95°C) pękają wiązania wodorowe i podwójna helisa DNA rozdziela się na dwa pojedyncze łańcuchy. W temperaturze niższej, ściśle określonej dla danej pary starterów (pomiędzy 45-70°C), przyłączają się one do matrycy. Podwyższenie temperatury do około 72°C powoduje utworzenie się na matrycy, z przyłączonymi do niej starterami, kompleksu z polimerazą DNA, wskutek czego rozpoczyna się synteza nici komplementarnej do matrycy.

Gdyby wydajność metody była stuprocentowa, po <math>n</math> cyklach reakcji z jednej cząsteczki można by uzyskać <math>2^n</math> cząsteczek. W praktyce wydajność jest mniejsza, co nie zmienia faktu, że metoda PCR znajduje wiele zastosowań, m.in. w klonowaniu genów, diagnostyce klinicznej, identyfikacji osób zaginionych, kryminalistyce, pracach nad gatunkami, które wyginęły.

Stosuje się również modyfikacje metody PCR m.in:

• RT-PCR (Reverse Transcription) modyfikacja polegająca na użyciu mRNA jako matrycy. Synteza DNA na matrycy mRNA odbywa się przy użyciu odwrotnej transkryptazy (RT). Metoda ta pozwala na amplifikację wyłącznie sekwencji zawartej w dojrzałym mRNA, a więc tylko egzonów. Powstały DNA określany jest jako cDNA – komplementarny DNA.
• Real time PCR – do środowiska rekacji wprowadzane są znakowane (np. barwnikami fluorescencyjnymi) nukleotydy, bądź sondy łączące się z DNA, które pozwalają na podstawie odczytów w kolejnych cyklach określić ilość matrycy użytej do reakcji, jak również śledzić ilość powstającego produktu.
• PCR-RFLP
• RG-PCR
• ACRS-PCR
• ARMS-PCR
• ASA-PCR
• PCR-ASO
• PCR-HD
• PCR-SSCP
• PCR-DGGE
• PCR-TGGE
• inversed PCR
• PCR-OLA
• PCR-CCM
• PCR-PTT

• http://www.gene-quantification.info - The reference in real-time PCR.

<span class="FA" id="de" style="display:none;" />

Kategorie

Znajdź

Znajdź